H에 의한 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(PMO)의 수렴 합성

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 12576(2023) 이 기사 인용

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포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(PMO)는 유망한 유형의 안티센스 올리고뉴클레오티드이지만 합성이 어려워 접근이 어렵습니다. 이 연구는 H-포스포네이트 접근법을 사용하여 PMO에 대한 효율적인 합성 접근법을 제시합니다. 포스포늄형 축합 시약을 사용하면 현재 합성 접근 방식에 비해 결합 시간이 크게 단축되었습니다. 또한, 포스포늄형 축합 시약은 PMO의 단편 축합을 촉진하여 놀라운 결합 효능을 지닌 4개의 핵염기를 모두 포함하는 최대 8량체를 합성했습니다. 이는 PMO의 수렴 합성에 관한 첫 번째 보고서입니다. 이러한 접근법은 PMO의 대규모 합성을 촉진하고 차세대 치료법으로서의 인기와 접근성을 가속화할 것입니다.

안티센스 접근법은 질병 관련 유전자의 발현을 조절하기 위한 잠재적인 미래 치료법으로 연구자들의 관심을 끌었습니다. 비이온성 뉴클레오티드간 연결 및 모르폴리노 백본을 갖는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(PMO)는 유망한 안티센스 약물로 간주됩니다4,5. 이전 연구에서 표적 mRNA4에 대한 높은 결합 친화도, 서열 특이성6,7, 물에 대한 용해도6, PMO7,8,9,10의 낮은 독성이 확인되었습니다. 현재까지 Duchenne 근이영양증에 대한 4가지 안티센스 약물(Exondys 51®11, Vyondys 53®12, Viltepso®13, Amondys 45®14)이 승인되었으며 앞으로 더 많은 PMO 약물이 승인될 것으로 예상됩니다. 또한, TMO(티오포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드)라고 불리는 새로운 PMO 유사체가 합성되어 안티센스 치료에서 새로운 약물 후보로서의 가능성을 보여주었습니다15. PMO의 급속한 발전으로 인해 PMO 및 PMO 유사체 합성을 위한 효율적인 접근 방식을 개발해야 하는 요구 사항이 증가했습니다. 특히 PMO를 한번에 대규모로 합성할 수 있는 합성 접근법은 환자에게 안티센스 치료법을 제공하기 위해 필요하다. 지금까지 많은 합성 접근법이 개발되었습니다. PMO에 대한 최초의 합성 접근법은 Summerton과 Weller5에 의해 보고되었습니다(그림 1-A). 이 접근법에서, 5'-하이드록시 그룹에 N,N-디메틸아미노클로로포스포르아미데이트 부분을 보유하고 아미노 그룹에 트리틸(Tr) 그룹을 보유하는 모르폴리노 뉴클레오시드가 단량체 단위(A)로 사용되었습니다. PMO는 단량체(A)의 5'-N,N-디메틸아미노클로로포스포라미데이트기와 올리고머의 3'말단의 Tr기를 제거한 후 아미노기와의 축합을 반복함으로써 합성되었다5. 이 접근법은 널리 사용되지만 단량체의 낮은 반응성과 축합 반응을 완료하는 데 걸리는 긴 반응 시간을 포함하여 몇 가지 인식된 문제가 있습니다. 2012년 Harakawa et al. 반응 혼합물에 LiBr을 첨가하는 것이 효과적이며 반응이 상당히 가속화된다는 사실을 발견했습니다(약 10배 개선)16. 또한 Li et al.17은 반응 온도를 90°C로 높임으로써 축합 반응이 8분 이내에 완료되어 유동 반응기를 사용하여 단 3.5시간 만에 18mer-PMO를 합성할 수 있음을 발견했습니다. Kundu 등18은 자동화 올리고 합성기를 이용한 PMO 합성을 보고하였다. 이 보고서에서는 Fmoc 화학을 사용하여 3량체 PMO의 용액상 합성을 달성했습니다. 또한, 30량체 PMO는 DNA 합성기에 의해 합성되었습니다.

PMO 파생상품 합성을 위한 현재 접근법.

최근 Langner 등은 포스포로디아미다이트 유도체를 단량체로 사용하여 TMO를 합성하는 새로운 합성 접근법을 보고했습니다(그림 1-B). PMO와 달리 TMO는 포스포로티오아미데이트 결합을 가지고 있어 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 유망한 특성을 보여줍니다. TMO는 높은 RNA 결합 친화성과 높은 뉴클레아제 안정성을 보여주었습니다. 더욱이, 키메라 TMO는 마이크로RNA 억제제로서의 잠재력을 보여주었습니다. 그림 1-B에 표시된 대로 이 접근법은 5'-하이드록시 그룹(B)에 4,4'-디메톡시트리틸(DMTr) 그룹을 갖는 모르폴리노 포스포로디아미다이트 유도체를 단량체 단위로 사용합니다. 합성 공정에는 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)과 같은 산성 활성화제 존재 하에서 모르폴리노 포스포로디아미다이트 단량체(B)를 올리고머의 5' 말단에 있는 하이드록시기와 축합한 후 황화시키는 과정이 포함됩니다. 포스포르아미다이트 중간체(C). 후속적인 탈트리틸화와 반복적인 합성 주기로 TMO가 생성되었습니다. 보고된 커플링 수율은 95-97%였으며 축합 반응 시간은 5분이었습니다. 이 접근법은 TMO 합성에는 효과적이지만 PMO 합성에는 적용할 수 없습니다. 이 방법은 중간체로서 포스포라미다이트 유도체(C)를 얻었지만, 이 중간체로부터 원하는 PMO의 포스포로디아미데이트 결합을 얻지 못했습니다.

PyNTP > PyBOP. This could be due to the ability of leaving groups (HOBt or 3-nitro 1,2,4-triazole (NT)) and the structure of the phosphonium center26,27. However, in this method, PyNTP showed a better result for the condensation reaction. The lower NMR yield using MNTP was due to the formation of by-products. Due to the higher activity as a condensing reagent, the activation of 2c by MNTP might have led to the overactivation and caused inferior condensing efficacy. Thus, BOPCl, BOMP, and PyNTP were selected as condensing reagents for further investigation./p> 99%; therefore, the conditions in entry 4 were selected as optimal ones. With the optimized reaction conditions in hand, phosphorodiamidate 2-mers bearing other nucleobases were synthesized (entries 5, 6, and 7). All 2-mers were obtained in > 99% NMR yields, demonstrating that the reactions proceeded efficiently regardless of the specific nucleobase. Although dimethylamine in H2O solution was used as the optimized conditions, the hydrolysis of the H-phosphonamidate linkage was not observed. It is attributed to the much higher reactivity of dimethylamine than that of H2O to the chlorophosphoramidate intermediate. These results were in good agreement with the previous reports29,30./p>